Angewandte Analysemethoden

Die Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) wird seit langem in medizinischen Laboren eingesetzt. Die AAS ermöglicht die Bestimmung der meisten Metalle und Spurenelemente in klinischen Proben. Im Medizinischen Labor Bremen werden alle in der AAS vorhandenen Techniken eingesetzt: Flammen-, Graphitrohr-, Hydrid- und Kaltdampftechnik. Die verschiedenen Techniken wurden entwickelt, um für ausgewählte Elemente Nachweisgrenzen zu verbessern oder unterschiedliche Konzentrationsbereiche abzudecken. Ergänzend und zur weiteren Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit findet auch die die Atomfluoreszenzspektrometrie (AFS) Einsatz, z. B. zur Bestimmung des Quecksilbers im Urin.

Bei der Gaschromatographie (GC), speziell der Kapillar-GC, besteht die stationäre Phase aus einer an die Innenwand einer dünnen Kapillare kovalent gebundenen hochviskosen Flüssigkeit. Die GC mit Kapillar-Trennsäulen bietet maximale Trennleistung auch in komplexen biologischen Matrices. Häufig ist eine chemische Vorbereitung der Probe (Derivatisierung) nötig, um die Überführung in die Gasphase zu erleichtern. Zur Auftrennung der Probe wird ein möglichst inertes Gas als mobile Phase eingesetzt. Zur empfindlichen Detektion von Drogen und Medikamenten eignet sich besonders der Stickstoff-Phosphor-Detektor (NPD).
 

GC-MS in der Toxikologie

Eine Besonderheit bei der GC ist die Elektronenstoßionisation zur Erzeugung substanztypischer Fragmentionen. Die aus der Elektronenstoßionisation resultierenden Massenspektren sind wie der Fingerabdruck einer Substanz und können mittels Spektrensammlungen identifiziert werden. Die besondere Stärke der GC ist deshalb die Suche nach unbekannten Substanzen (general unknown screening, Drogenscreening). Es gibt aber auch zahlreiche Anwendungen für die gezielte Analyse von Substanzen im Drug Monitoring und der Stoffwechselanalytik.

GC-MS in der Umwelttoxikologie

Die Kopplung von gaschromatographischen Kapillartrennsäulen mit massenspektrometrischen Detektoren (GC-MS) ermöglicht den empfindlichen und selektiven Nachweis von Arbeitsstoffen und/oder deren Metaboliten in komplexen Matrices wie Urin und Blut. Abhängig von den chemisch-physikalischen Eigenschaften der Analyte und der Komplexität der Matrix kommen unterschiedlich aufwändige Untersuchungsmethoden zum Einsatz. Flüchtige Arbeitsstoffe wie z. B. Lösungsmittel, werden mittels Headspace-Methoden direkt aus Blut untersucht. Schwer flüchtige Analyte wie z.B. PCBs, aromatische Amine, organisches Zinn oder Bisphenol A benötigen dagegen mehrstufige Methoden. Vor der eigentlichen Messung muss extrahiert, aufgereinigt und ggf. noch derivatisiert werden. Die Selektivität / Empfindlichkeit der GC-MS-Methode kann detektorseitig durch die Variante der chemischen Ionisierung in vielen Fällen enorm gesteigert werden.

Nicht selten stoßen GC-MS-Methoden bei komplexer Matrix und sehr niedriger Analyt-Konzentration auf Interferenzen und Limitierungen. In solchen Fälle nutzen wir die Vorteile der GC-Triple-Quadrupol Geräte (GC-MS/MS), um derartige Probleme zu lösen. Nach der Auftrennung des Ionengemisches im 1. Quadrupol zerfällt ein ausgewähltes Ion im 2. Quadrupol durch eine Stoßreaktion in Tochterionen. Der 3. Quadrupol isoliert aus diesem Gemisch das eigentliche Analytion, das in der Regel frei von störenden Matrixbestandteilen detektiert wird. Nur mit dieser Technik lassen sich z. B. Rückstände von Glyphosat / AMPA oder die Metabolite der Neo-nicotinoide im Urin nach beruflicher sowie nicht-beruflicher Exposition selektiv analysieren.

Die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ist ein schonendes Trennverfahren aus flüssigen Proben mit vielfältigen Anwendungen in Forschung und Routine. Im medizinischen Bereich macht man sich die hohe Trenneffizienz und gute Automatisierbarkeit zu Nutze, um störende Matrixkomponenten vom gewünschten Parameter gezielt abzutrennen. Der Nachweis der Parameter erfolgt mittels UV/vis- bzw. Fluoreszenzspektroskopie oder mittels elektrochemischer Verfahren. Das MLHB besitzt langjährige Erfahrung im Bereich der der HPLC, die in zahlreichen robusten Methoden Anwendung finden.

Die Kopplung der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit der Massenspektrometrie (MS) mit Hilfe sanfter Ionisationsverfahren bei Atmosphärendruck ist eine Schlüsseltechnologie der modernen Analytik. Die Verbindung von sehr hoher Sensitivität (bis in den ng-pg/L Bereich) mit exzellenter Selektivität durch Tandemmassenspektrometrie (MS/MS) erlaubt einen breitgefächerten Einsatz im medizinischen Labor. Die MS/MS Technologie mit Hilfe von Triple Quadrupole Massenspektrometern (QQQ) basiert auf folgenden Schritten:

1. Selektion der Masse des gewünschten Analyten im ersten Quadrupol;
2. Fragmentierung des Analyten in einer Kollisionszelle (Quadrupol); 
3. gezielte Auswahl der Masse eines oder mehrerer Fragmente im dritten Quadrupol.

Im Gegensatz zu rein optisch basierten Detektionsverfahren können so Interferenzen effizient minimiert werden.

Die Massenspektrometrie mit dem induktiv gekoppelten Plasma als Ionenquelle (ICP-MS) ist die herausragende Methode in der Elementspurenanalytik in klinischen Proben. Sie kombiniert ein ausgezeichnetes Nachweisvermögen mit Multielementfähigkeit. Viele Elemente können bis in den Ultraspurenbereich (ng/L) bestimmt werden. Die ICP-MS findet Einsatz zur Bestimmung fast aller toxikologisch relevanter Metalle im Blut, Urin oder Haaren. Auch die Bestimmung essentieller Spurenelemente im niedrigen Konzentrationsbereich ist möglich (z.B. Iod oder Selen). Mehr als 90% aller Elemente des Periodensystems können mit der ICP-MS in Lösungen unterhalb von 1 µg/L bestimmt werden.

Bei der ICP-MS verbleiben Störungen bzw. Limitierungen, die uns veranlasst haben, noch weiterentwickelte Methoden einzusetzen. Bei der ICP-MS/MS nutzen wir den Effekt der Tandem-Massenspektrometrie. Dabei erfolgt eine erste Trennung der Ionen im ersten Quadrupol. Danach erfolgt in einem Oktopol z. B. eine Reaktion der Analytionen zu einem höheren Masse- zu Ladungsverhältnis, wonach dann im zweiten Quadrupol das Analytion von den störenden Ionen endgültig (hochselektiv) getrennt wird.

Nur mit dieser Methode lassen sich z.B. niedrige Titan-Konzentrationen im Blut bestimmen. Titan ist ein wichtiger Parameter, der den Zustand von Implantaten im Körper beschreibt (Hüfte, Knie, etc.). Auch die Bestimmung des stark toxikologisch relevanten Chroms nach Abrieb oder Korrosion von Implantaten gelingt nur mit dieser Methode störungsfrei.relevanten Chroms nach Abrieb oder Korrosion von Implantaten gelingt nur mit dieser Methode störungsfrei.

Schon seit vielen Jahren, aber immer noch als eines von nur ganz wenigen medizinischen Laboren, setzen wir die Kopplung der Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit der ICP-MS ein. Bei dieser Methode wird das sehr hohe Trennvermögen der HPLC mit dem ausgezeichneten Detektionsvermögen der ICP-MS gekoppelt. Dies ermöglicht die Bestimmung einzelner Element-Spezies. So können mit dieser Methode die toxischen Arsen-Spezies As(III) und As(V) sowie deren Metaboliten Methylarsonat (MMA) und Dimethylarsinat (DMA) bestimmt werden und zudem vom weniger toxischen Arsenobetain differenziert werden. Genau dieses Arsenobetain kann aber durch Fischverzehr aufgenommen und auch über den Urin wieder ausgeschieden werden. Daraus würden tendenziell falsch positive Befunde entstehen. Mit HPLC-ICP-MS aber werden alle Arsen-Spezies gemeinsam bestimmt und dadurch zwischen toxischen und weniger toxischen Spezies differenziert. Dieses vermeidet falsch positive Befunde.

Die optische Emissionsspektrometrie mit dem induktiv gekoppelten Plasma als Strahlungsquelle (ICP-OES) ist für klinische Proben eine wertvolle Ergänzung zu den Methoden der AAS und ICP-MS und unter Qualitätsgesichtspunkten unverzichtbar. Mit der ICP-OES (häufig auch ICP-AES) lassen sich Metalle in Lösungen bis in den unteren µg/L-Bereich bestimmen. Bei klinischen Proben ist die ICP-OES in erster Linie zur Bestimmung der Mineralstoffe und essentieller Spurenelemente von Bedeutung. Wir setzen die Methode aber auch für andere Fragestellungen in den Bereichen Pharmazie, Lebensmittel, Umwelt, Metalle und für Studien ein.